Mecanismo de rejeição:

 Quando  um tecido estranho chega ao nosso organismo, partes dele (algumas células do tecido) se desprendem e são levados aos tecidos linfóides secundários, como os linfonodos e/ou baço, onde as células apresentadoras  de antígenos apresentam o antígeno ao LThelper (item anterior) .Como foi visto na figura 1.1, os linfócitos T citotóxicos são altamente estimulados pela interleucina 2 e interferon gama  que vem dos linfócitos T helper 1 ativados. Estas interleucinas estimulam a expansão clonal dos linfócitos T citotóxicos e a sua ativação para o ataque (veja ítem 3.2).

Ocorre também uma apresentação direta do antígeno ao linfócitos T citotóxicos através do reconhecimento do MHC-classe I estranho na superfície das células estranhas do enxerto, através da interação MHC-1  e TCR (figura 1.4).
Esses linfócitos T citotóxicos possuem receptores CD8 e TCR. O TCR e o CD8 próprio do LTc é capaz de reconhecer o MHC-I que possui uma seqüência de aminoácidos estranha que está presente nas células. Observe que expressão desses MHC-classe I está aumentada, visto que o IFN-gama (seu estimulante) também está aumentado. Após o reconhecimento, ocorre lise do tecido estranho pelas células citotóxicas. No endotélio estranho que compõem o tecido enxertado, é expresso  o MHC-classe II,  que é reconhecido pelos LT-helpers que chegam ao local e  que induzem ainda mais a resposta contra o tecido. Os LT-helpers ativados nos tecidos linfóides e diretamente no local (como os endotélios) podem ativar a resposta imune humoral, que forma anticorpos antienxertos.
Esse mecanismo de rejeição ocorre da mesma forma para células neoplásicas (tumorais), pois possuem alterações nos seus MHC-1 ( receptores neoformados)

Fig. 1.4 - A. Esquema que demostra o mecanismo de rejeição a uma tecido estranho e a importância do MHC-1. B. esquema do o processo de reconhecimento do MHC-1 de uma célula infectada por um vírus. Os peptídeos virais em vermelho são formados por ribossomos da própria célula e se origina de RNA-mensageiro viral que esta parasitando a célula. Veja a importância do INF-gama e da IL-2 na expansão e na ativação dos LTc para o ataque.

RIC (Resposta Imune Celular)  contra vírus:

 Na  RIC que se desenvolve contra vírus e outros, ocorre  a migração destes até os linfonodos satélites. Da mesma forma há a apresentação do antígeno pelos macrófagos aos LT helper-1, que fazem  uma expansão clonal  formando  uma imensa população.  Nesta expansão, formam-se também células T de memória  que vão “guardar” dentro de si as informações sobre o antígeno. Essas informações servem para a resposta imune secundária, na qual  o antígeno entra  em  contato com o sistema pela segunda vez  e é rapidamente reconhecido (por células que memória) e atacado (veja ítem 3.3).

 Estes LTh-1 da população clonal formam IL-2 e IFN-gama que ativam os LT-citolíticos ou citotóxicos, que vão aumentar o nível da expansão clonal deles e elevar o seu metabolismo interno.
 Mas o que ocorre numa infecção por vírus, além da apresentação do antígeno aos LT-helpers, é a apresentação direta aos LTc que chegam até as células infectadas. Essas células ,que possuem o vírus se multiplicando no seu interior, vão manifestar peptídeos virais  em cima da seqüência de aminoácidos do MHC-classe 1 (fig.1.4). Esse processo ocorre na hora de sintetizar o MHC-1.  Quando a vesícula exocítica contendo as cadeias do MHC-1 recém traduzidas no retículo endoplasmático rugoso estão a caminho da superfície, ocorre uma fusão com uma vesícula contendo peptídeos virais intrínsecos da célula. Então, o MHC-1 chega na superfície contendo esses antígenos virais unidas à sua cadeia de aminoácidos. O receptor CD8 dos LTc se encaixo na MHC-1 lateralmente e o TCR dos LTc reconhece a cadeia estranha e ativa o  ataque à célula (ítem 3.2).
 

Há dois modos de LTc atacarem os vírus:
 1- Destruindo as células hospedeiras infectadas, que são fontes das partículas virais replicadas;
 2- Liberando de grande quantidade de interferon gama, que embora seja uma molécula reguladora, é também um importante antiviral, pois induz a célula hospedeira a produzir uma proteína antiviral protetora que impede a formação de proteínas virais.
 É importante que saibamos que uma célula do nosso organismo que contenha antígenos capsulares de vírus na sua membrana plasmática (como o gp120 do vírus HIV) é reconhecida por linfócitos T citotóxicos ativados, que destróem não só o vírus, mas destroém a célula toda através da liberação de substâncias citolíticas.

 RIC (Resposta Imune Celular)  contra fungos ou bactérias:

Um infeção por fungos, micobactérias não ocorre diretamente pelo reconhecimento dos linfócitos T citotóxicos, mas sim pela extrema participação dos linfócitos T helpers-1 que, como foi explicado anteriormente, fazem o reconhecimento nas células apres. de ant. e liberam citocinas estimuladoras de LTc. Nos aidéticos, há um défict de LT-helper, e infecções por fungos ocorre frequentemente e de forma mais grave.
 Devemos nos lembrar que: com a ativação dos LTh-1 ocorre também a estimulação para a formação de uma clone de células de memórita LTm específicos para o antígeno que vai permanecer sempre no organismo e se manifestar nu

 ma resposta imune secundária.

 3.2 - Mecanismo de  desenvolvimento e de lise celular  dos  LTc

 No timo,  formam se linfócitos T que não são ainda capazes realizar a resposta imune. Os LTc que saem no timo apenas são capazes de reconhecer o antígeno ligado ao MHC-classe 1 ou MHC estranho exposto na célula-alvo.
 A capacidade de lise celular (ativação) dos LTc é feita pelo contato dos LTc que sairam do timo e o MHC-1 estranho, e por citocinas como IL-2 e interferon gama (e Il-6) liberadas pelos LTh-1 que foram ativados. Quando essas citocinas atingem os LTc ligados ao MHC-1 estranho, vão ativar a diferenciação completa destas células em células capazes de lisar a célula-alvo.
 O mecanismo de lise é antígeno específica para o MHC-1 estranho e se baseia na liberação de enzimas que formam poros na

Fig. 1.5 - Esse esquema demostra o ativação para o ataque que ocorre no linfócito T citotóxico. Para a sua ativação, são necessários dois sinais, um vindo da interação MHC-1:TCR-CD3 e o outro pela IL-2 e INF-gama liberado pelos LTh. O mecanismo intrínseco de ativação é igual ao LTh (fig.1.3), visando nesse caso a liberação de perforina e da toxina celular. Os LTc que saem do timo vão aos tecidos linf. secundários (linfonodos...) onde encontram células alvo que foram carreadas pela linfa. O LTc reconhece e ataca a célula. Os LTc podem sair dos linfonodos e ir para o tecido da onde originou a célula estranha. Nesse tecido haverá o ataque as células alvo, da mesma forma que nos tecidos linfóides secundários.

membrana plasmática das células-alvo e as mata por osmose e também pela indução da apoptose ( veja figura 1.5).

Este processo pode ser dividido em etapas:

 Etapa 1 : Reconhecimento do antígeno. É a ligação do LTc formado no timo com o MHC-1 estranho e formação do complexo MHC(antígeno)-TCR-CD3.
 Etapa 2 : Ativação do LTc. Após o reconhecimento e o contato com as citocinas (INF-gama e Il-2) ocorre a ativação intrínseca do linfócitos mediado pelo CD3 da mesma forma que nos LTh (fig. 1.3.), porém não visa a apenas a produção de citocinas , mas principalmente e a produção de enzimas hidrolíticas e  a fosforilação de proteínas de liberação de grânulos lisossômicos por exocitose. O INF-gama é a única citocina importante produzida pelos LTc ativados numa infecção viral.
 Etapa 3 : Golpe letal : Com liberação de enzimas  como a perforina, ocorre a formação de poros na membrana da célula-alvo. A toxina celular é também liberada.
 Etapa 4 : Desligamento do LTc : O LTc se desliga da célula-alvo e se afasta.
 Etapa 5 : Morte : A célula alvo contendo poros em sua membrana vai sofrer tumefação osmótica seguido de lise celular e morte. Há também outras substâncias liberadas ou não pelos grânulos como a toxina celular. Essa toxina entra na célula-alvo e ativa enzima da apoptose (morte programa da célula) como a endonuclease, que vai clivar o DNA da célula e fazer rápida condensação da cromatina nuclear.

3.3  - Hipersensibilidade do tipo retardado

 A hipersensibilidade do tipo retardado é um forma de resposta mediada por células, em que a célula efetora final é o fagócito-mononuclear (macrófago) ativado. Este tipo de imunidade celular é o mecanismo de defesa primário contra as bactérias intracelulares, como Listeria monocytogenes, micobactérias e Leishmania sp. Essa reação pode ser demonstrada pelo teste intradérmico  feito por injeção de antígenos em indivíduo com infecção prévia ou em indivíduos sensibilizados por agentes químicos ou ambientais.
 Como resultado dessa reação, ocorre uma inflamação no local com formação de granuloma e a resolução é mediada pelos macrófagos.

 Etapas da Hipersensibilidade retardada:

 Etapa de sensibilização do indivíduo:
 A primeira etapa é uma fase congnitiva, no qual o indivíduo entra em contato pela primeira vez com o antígeno e se torna sensibilizado.
 Consiste na fagocitose do antígeno pelo macrófago e a apresentação do antígeno ao LTh-1. A maioria dessa apresentação ocorre nos linfonodos, onde os macrófagos contendo os antígeno chegam até os nodos e os apresentam aos LTh-1. Essas células apres. de ant. produzem IL-1, que junto com o antígeno apresentado vão promover a ativação dos LTh-1 que vão formar IL-2. A IL-2 formada induz a formação de clones de LTh-1 específicos e LT de memória específicos (LTm). Os LTh-1 ativam a resposta imune celular contra o antígeno no local da infecção, através da secração citocinas, até a sua resolução.
 A partir daí o indivíduo está sensibilizado pelo resto da vida, devido a permanência dos LTm.

Etapa de ativação da  reação de hipersensibilidade retardada :

 Quando o indivíduo entra em contato pela segunda vez com o antígeno, estando ele sensibilizado, irá se desenvolver a reação de hipersensibilidade retardada.
 Células de Langerhans  da pele (ou outra CAA) que permanecem no local de sensibilização  entram em contato com produtos bacterianos, como o LPS de gram negativas, parede celular de micobactérias e outros. Este contato faz com que essas células liberem muita IL-1 e FNT que vão recrutar linfócitos para o local. Os  Linfócitos de memória que chegam, são apresentados as antígenos pelos macrófagos.  A população LT de memória já existente no indivíduo se torna ativada e começa produzir citocinas como a IL-2, INF-gama e TNF que caracterizam a inflamação.
 As células endoteliais das vênulas também tem a capacidade de apresentar os antígenos aos LT de memória que cheguem ao local, através da expressão do MHC-classe II. Elas também secretam interferon alfa (INF-alfa) e prostaciclina

Etapa da inflamação:efeito das citocinas

 As citocinas realizam os efeitos que caracterizam a reação de hipersensibilidade retardada:
 A IL-2 - Induz a proliferação dos LT de memória específicos e de LT não específicos que chegam ao local.
 O INF-gama ativa a fagocitose nas células apre. de ant. (macrófagos) e aumenta a expressão do MHC-classe II ampliando a apresentação do antígeno.
 TNF estimula as células endoteliais das vênulas a expressarem o receptor de leucócito ICAM-1 que é molécula de adesão para neutrófilos e linfócitos. Essa adesão potencializa o processo de inflamação. O TNF também potencializa a síntese de prostaciclina pelo endotélio, que é uma prostaglandina vasodilatadora. Com isso ocorre uma hiperemia no local. O TNF também é  capaz de estimular o endotélio a mudar a conformação da sua membrana basal, permitindo que macromoléculas do sangue extravazem para o tecido. O fibrinogênio que extravaza é a base da enduração presente nos testes intradérmicos.

Etapa final: Resolução da reação

 Como foi dito no início deste ítem, os macrófagos são responsáveis pela resolução da reação.
 Os monócitos vindos do sangue chegam ao tecido e se diferenciam em macrófagos. Ele é responsável pela fagocitose de bactérias e outros microorganismos ou outros antígenos.
 O INF-gama é o principal ativador de macrófagos, estimulando-os a fagocitose, a síntese de receptor FCgamaR (de IgG para opsionização).
 A ativação completa do macrófago é feita por produtos bacterianos como LPS ou parede celular das bactérias que agem junto com o INF-gama. Os macrófagos ativados secretam diversas substâncias que vão realizar funções diversas:
 - Prostaglandinas e leucotrienos  (mediadores da inflamação);
 - IL-1 (ativador de linfócitos e fator de proliferação de macrófagos), responsável pela febre e potencializa a inflamação, pois ativa a via ciclo-oxigenase na síntese de prostaglandinas.
 - TNF (ampliador da atividade linfocítica)
 - GM-CSF (estimulador de colônias) - veja capítulo 1
 - PAF (Fator de crescimento derivado de plaquetas). Estimula o crescimento e proliferação de fibroblastos. É responsável também à angiogênese, pois estimula a migração e proliferação de células endoteliais.
 -TGF-beta (fator de crescimento transformador-beta). Este fator junto com o PAF é de suma importância para a formação de tecido conjuntivo no local inflamado. Ele ativa formação de colágeno pelos fibroblastos. Por isso na inflamação crônica, com a persistente secreção de TGF-beta e PAF, forma-se fibrose como resultado de resolução feita pelo macrófago.

Testes intradérmicos Tipo PPD

 PPD é um tipo de teste no qual é injetado um antígeno intradermicamente no indivíduo para detectar a sensibilidade daquele paciente ao antígeno, ou seja , testa a sua capacidade de resposta imune celular a partir dos LT de memória observando na pele uma enduração (granuloma). A presença dessa enduração e o seu tamanho vão indicar o nível de sensibilidade.
 O antígeno do PPD é um Derivado Proteico Purificado , obtido de um caldo de cultura onde cresceram Mycobacterium tuberculosis, aquecido, filtrado e diluído.
 A injeção intradérmica (de 0,1 mL) é feita na face ventral do antebraço dentro da derme . Aparecerá uma resposta imune de hipersensibilidade tardia na pele de indivíduos que já tiveram contato com o bacilo de Kock. Esse contato é feito de várias formas, como a vacina BCG ou contato com o bacilo (pessoas que já tiveram tuberculose), no qual o indivíduo desenvolveu uma sensibilização do seu sistema imune e formou LT de memória. Pessoas que estão com tuberculose dão uma reação tão forte que chega a necrosar a região do braço aplicada com a injeção. Veja figura 1.6

Fig. 1.6 - Este esquema ilustra o principal mecanismo imunológico que ocorre numa reação de hipersensibilidade como o PPD. Com a inoculação do antígeno, estando o indivíduo sensibilizado (com LTm formados), o macrófago é e as células endoteliais das vênulas apresentam o antígeno aos LTm, que vão se ativar e secretar ativamente as citocinas, entre ais quais estão o TNF, INF-gama e IL-2. O TNF altera a membrana basal do endotélio, deixando estravazar proteínas (fibrinogênio) para tecido e também estimula a síntese de PGE2 na vênula. A PGE2 é um vasodilatador, fazendo elevar o fluxo sangüíneo no local. O INF-gama ativa macrófagos e a IL-2 estimula a proliferação dos LTm específicos existentes. O macrófago ativado produz IL-1 e mais TNF, que juntos, atraem mais linfócitos ao local.

 Cerca de 4 horas após e injeção, neutrófilos se acumulam na vênulas no local de injeção e algumas horas depois esse infiltrado desaparece. 12 horas após a injeção, monócitos  chegam ao local e viram macrófagos, que começam a apresetação do antígeno aos LTm. Inicia-se a ativação violenta de LTm que vão recrutar grande população de linfócitos até o local. Essas células se localizam ao redor das vênulas da derme e iniciam a inflamação local através da secreção de citocinas (descrita anteriormente). O fibrinogênio escapa dos vasos (por ação do TNF) e na derme é convertido à fibrina. A fibrina em grande quantidade, unida às células (monócitos, macrófagos, linfócitos, células de Langehans...)  na derme em volta das vênulas dão o aspecto intumescido (endurado) na região do braço. Esse aspecto só aparece por volta de 18 horas após a injeção, sendo máxima por volta de 12-24 horas (esse intervalo até apacer o endurescimento que dá o nome a reação-retardada). Macrófagos em grande número vão resolver a reação que  o braço volte o que era antes.

 A interpretação clínica do endurado é feito da seguinte forma :

 - Ausente ou até 4 mm - NÃO REATOR. Não apresenta proteção, ou seja, não tem LTm contra antígenos do bacilo.
 - 5 a 7mm - REATOR FRACO. Proteção contra tuberculose, ou seja , existe LTm formados que confere ao indivíduo uma boa resposta imune secundária se ele tiver contato outra vez com o bacilo. Com certeza, ou indivíduo foi vacinado com BCG ou já teve alguma forma de tuberculose.
 - 8mm ou necrose - REATOR FORTE. Suspeita-se de infecção ativa da tuberculose, pois a reação é extremamente forte, o indivíduo deve estar com uma população de linfócitos T ativos, levando até a uma necrose na região do braço.

Pacientes que estão com tuberculose comprovada e são anérgicos, ou seja, não reatores no teste PPD, possuem alguma deficiência de linfócitos T (ou até AIDS grave) ou estão tomando alguma droga imunossupressora. Esses pacientes estão em situação mais grave, e a doença pode evoluir rapidamente e até levar a morte.
 Há vários outros agentes infecciosos, como os fungos, que se faz o teste tipo PPD usando o antígeno extraído da cultura do fungo.Ex:

 Coccidioides immitis - Coiccidiodina é o antígeno extraído de cultura. A enduração aparece na pele em 24-48 horas após a aplicação. Se o resultado for negativo, tem duas opcões: ou a suspeita está errada, ou a doença está na forma disseminada. 15% dos pacientes apresentam eritrema nodoso na pele por hipersensibilidade tardia sem a inoculação do antígeno. Isso ocorre porque antígenos do fungo atingem a derme por via hematogênica e ativam a reação. Estando o paciente com baixa resposta imune celular (anergia) e infectado com o fungo, haverá uma intensa proliferação desse agente no organismo (septicemia) incluindo derrame plueral, pneumonia etc. , podendo até levar à morte.
 Histoplasma capsulatum - o teste é feito com histoplasmina extraído da cultura. Sendo negativo, há possibilidade de disseminação (baixa RIC) para o baço, fígado, nariz, boca, intestino.
 Blastomyces dermatidis - antígeno blastomicina. O teste PPD é positivo em 50% dos casos devido a baixa especificidade do teste.
 Paracoccidioides brasiliensis - antígeno paracocidioidina, sendo positivo na maioria dos pacientes com paracoccidioidomicose. O resultado negativo leva a hipótese de disseminação para o baço, fígado, mucosas e pele, formando granulomas (inflamação crônica) nesses locais.

 Na Hanseníase ("lepra") também é feito teste intradérmico de forma semelhante ao PPD, entretanto o antígeno é de Micobacterium leprae. Esse antígeno é denominado de antígeno Mitsuda. Como não há ainda um modo de cultivar essas bactérias em meio de cultura, o Mitsuda é obtido de lepromas fervidos, homogeinizados em solução salina durante 60 minutos, centrifugado em Milipore e adicionado fenol a 0,5%.
 O teste é realizado injetando-se 0,1 mL do antígeno na face ventral do antebraço e a leitura da reação é feita após 21 dias.
 Com esse teste é possível saber se o paciente tem a forma tuberculóide, wirchoviana ou negativa.
 Na forma tuberculóide detectamos a enduração no braço, pois o indivíduo tem boa resposta imune celular. Explicaremos a seguir o motivo pelo qual isso ocorre:

Na forma tuberculóide, o paciente possui uma forma de resistência, que é devido a sua população de LTh-1ou LTh-1 de memória  produzindo interferon gama e interleucina 2 que, como vimos anteriormente, inicia a reação imune celular . Com a RIC, esse paciente consegue freiar o desenvolvimento da população de bacilos, pois os macrófagos ativados vão fagocitá-los. Então haverá o endurescimento na pele por ativação dos LTh-1.
 Na forma  lepromatosa ou wirchoviana, o paciente não tem resistência, que é devido a sua população de LTh-2, que como vimos antes, produz IL-4 e IL-10. A IL-4 inibe o interferon gama e a IL-10 inibe a expansão clonal dos LTh-1 e LTh-1m. Então não ocorre nem o início da RIC e o indívíduo fica sem resposta, havendo proliferação de bacilos dentro dos macrófagos, sendo estes incapazes de realizar a digestão intracelular pela ausência de INF-gama. Por isso a reação de Mitsuda é negativa (sem reação).
 A reação pode esta ausente em pessoas que não tem a doença, e não formou linfócitos específicos contra o bacilo.